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病理科主要通過制病理切片完成免疫組化實驗來診斷疾病。用來制作病理切片的組織樣有括宮頸、痰、胸腹水及尿液等。病理切片有石蠟切片和冰凍切片兩種,常見的是石蠟切片。
1 取材、固定:獲取的組織樣本經(jīng)離心等處理后加入固定液,病理切片最常使用的固定液為10%福爾馬林(4%甲醛)或10%磷酸緩沖福爾馬林。固定液的用量一般為樣本的20倍左右。
2洗滌、脫水、透明:固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀,否則會影響后期的染色效果。因此先用自動脫水機或乙醇對樣本進行脫水。純酒精不能與石蠟相溶,還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液,替換出組織內(nèi)的酒精,這種媒浸液稱為透明劑。常見的透明劑有有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等。
3浸蠟與包埋:把樣本放入盛有石蠟液的石蠟包埋機中進行包埋,在包埋機中經(jīng)冷卻制成固體樣本。
4切片:包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺,以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上,夾在石蠟切片機的蠟塊鉗內(nèi),使蠟塊切面與切片刀刃平行,進行石蠟切片。
5貼片與烤片:在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油,再將一定長度蠟帶(連續(xù)切片)或用刀片斷開成單個蠟片于溫水(45℃左右)中展平后,撈至玻片上鋪正,烘干或晾干。
6切片脫蠟與水化:干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進行染色。用二甲苯脫蠟,再逐級經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中,則將切片移至與酒精近似濃度時,即可染色。
7抗原修復(fù):由于之前的化學(xué)試劑對抗原進行了封閉,熱作用使抗原肽鏈扭曲會導(dǎo)致免疫組化染色不能顯示,因此進項抗原修復(fù)。把玻片放在檸檬酸緩沖液(95-99℃)10分鐘,冷卻后放在EDTA溶液(95-99℃)15分鐘,然后直接放在10 mM TE/1 mM EDTA溶液中(95-99℃)18分鐘,最后用胃蛋白酶37℃消化30分鐘。
8染色、觀察:加入抗體后4℃孵育過夜,染色。染色成功后用蒸餾水進行沖洗,脫水后蓋上蓋玻片放在顯微鏡下觀察。
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